[~AnnA~]

NGJYROSJA SIPAS GRAMIT

Kolonia e baktereve thahet në xham mikroskopik dhe më tej procedohet si vijon (Figura 2 dhe 3):

Hapi 1. Ngjyrosja me kristal violet. Bakteret marrin ngjyrë të kaltër.

Hapi 2. Fiksimi me jod. Kjo procedurë e stabilizon ngjyrën kristal violete. Bakteret mbesin me ngjyrë të kaltër.

Hapi 3. Ekstraksioni me alkool apo me ndonjë tretës tjetër. Gjatë kësaj procedure disa baktere çngjyrosen (Gram negativet), por disa të tjera mbajnë të njejtën ngjyrë (Gram pozitivet).

Hapi 4. Ngjyrosja me safraninë. Bakteret Gram pozitive mbesin të kaltra, kurse bakteret Gram negative tashmë marrin ngjyrën e kuqe të safraninës.

Në vazhdim vrojtohen vetitë e baktereve me mikroskop. Pas vrojtimit, shtrohen këto pyetje:

A janë Gram-pozitive apo Gram-negative, bakteret e vërejtura?
Çfarë forme kanë ato - shkopthore, koke, spirale apo pleomorfe (formë e ndryshueshme)?
A janë të rradhitura veç e veç apo janë në çifte, vargje etj.?
Çfarë madhësie kanë qelizat bakterore të vërejtura?
Përveç ngjyrosjes sipas Gramit, në praktikën laboratorike mikrobiologjike ndonjëherë përdoren edhe ngjyrosje të tjera (psh. ngjyrosja e sporeve dhe ajo e kapsulave).

Në vazhdim të ecurisë së diagnozës mikrobiologjike, merret një koloni tjetër e ngjashme e bakteres nga pllaka kultivuese dhe ekzaminohet për veçoritë biokimike; p.sh., a i fermenton sheqernat, siç është llaktoza? Në disa raste, bakteret identifikohen përmes antitrupave komercialë që reagojnë me antigjenet e caktuar sipërfaqësor të tyre (p.sh. përmes aglutinimit). Po ashtu, për diagnozën e infeksioneve bakterore, në përdorim të gjerë janë edhe shumë teste komerciale molekulare.

Karakterizimi taksonomik i baktereve
Edhe përbrenda vetë llojeve bakterore ekziston një ndryshueshmëri e konsiderueshme. Prandaj, krahasimi i llojeve bakterore përfshin krahasimin e shumë nëntipeve për secilin lloj. Këto krahasime bazohen kryesisht në analizat kimike dhe molekulare.

Analizat kimike
Për studimin e strukturës së baktereve janë në dispozicion pajisje të sofistikuara, që kryesisht mundësojnë profilimin e acideve të ngopura, karbohidrateve ose profilimin ubikuitar (të gjithanshëm). Në taksonominë e baktereve, ndihmesë mund të ofrojë edhe karakterizimi i prodhimeve të sekretuara të metabolizmit (psh. alkoolet e avullueshme dhe acidet yndyrore me vargje të shkurtëra).

Analizat molekulare
Do të ishte ideale sikur të krahasoheshin sekuencat e tërë ADN-së kromozomale të baktereve. Por, kjo metodologji nuk është praktike, sepse për secilin nëntip të baktereve do të duhej bërë sekuentimi i miliona nukleotideve. Gjatë disa viteve të fundit është arritur sekuentimi i tërë gjenomit të ndonjërit përfaqësues (psh. një nëntipi) të disa llojeve bakterore. Kjo procedurë kërkon një punë voluminoze nga ana e shumë grupeve kërkimore të dedikuara vetëm për sekuentim. Në të kaluarën, ngjashmëria gjenomike ndërmjet baktereve është vlerësuar përmes raportit të përmbajtjes së guaninës (G) plus citozinës (C), e cila zakonisht është shprehur si përqindje (%GC). Sot, zbatohen dy alternativa të tjera: hibridizimi dhe sekuentimi (më së shpeshti për gjenin që kodon ARNr 16S).

Për të krahasuar afërsinë gjenetike të nëntipeve të ndryshme të baktereve përdoret teknika e ADN-ADN homologjisë-d.m.th. me çfarë përputhshmërie dy shtame të ADN-së nga bakteret e ndryshme lidhen-hibridizohen së bashku. Nëse ADN-ja nga dy nëntipet bakterore tregon shkallë të lartë të homologjisë (d.m.th. vargjet lidhen mirë), atëherë konsiderohet se këto nëntipe i përkasin të njejtit lloj të baktereve. ADN-ja e llojeve të ndryshme bakterore nuk tregon homologji të strukturës gjenetike.

Gjatë viteve të fundit, sekuentimi i molekulave ribosomale të 16S ARNr është bërë “standard i artë” në taksonominë e baktereve. Kjo molekulë përafërsisht posedon 1600 nukleotide në varg. Sekuentimi i 16S ARNr jep përgjigje në vlerësimin e ngjashmërisë së gjenomeve mbi nivel të llojeve duke lejuar krahasimin e afërsisë përgjatë tërë mbretërisë së baktereve. Llojet e afërta bakterore shpesh kanë sekuenca identike të ARNr. Kjo teknikë ofron një informatë komplementare të hibridizimit ADN-ADN. Në laboratorin e mikrobiologjisë klinike, përcaktimi i sekuencës së gjeneve 16S ARNr dhe regjioneve të tjera gjenetike përdoret për identifikimin e nëntipeve të baktereve.

Diagnoza e shpejtë mikrobiologjike pa kultivim paraprak të mostrave klinike

Disa mikrobe patogjene që prekin njeriun (përfshirë shkaktarët e tuberkulozit, sëmundjes së Llajmit dhe sifilisit) nuk mund të rriten fare në terrene ushqyese ose rriten në sasi të pamjaftueshme. Veçimi i këtyre mikroorganizmave është i ngadalshëm, madje nganjëherë edhe i pamundshëm. Megjithatë, në praktikën laboratorike ekziston mundësia e zbulimit të baktereve nga mostrat klinike, pa i kultivuar ato fare në terrene ushqyese.

Një shembull i diagnozës së shpejtë, që përdoret në shumë ordinanca mjekësore është zbulimi i antigjeneve të streptokokut hemolitik të grupit A. Kjo realizohet duke marrë strisho nga gryka e pacientit dhe duke nxjerrë drejtpërdrejt nga mostra antigjenin streptokoksik (pa e kultivuar paraprakisht në terren ushqyes). Antigjeni bakteror zbulohet përmes fenomenit të përngjitjes (aglutinimit) së antigjenit me antitrupat e lidhur në kokërrzat komerciale të lateksit.

Sekuencat e ADN-së së njeriut mund të amplifikohen drejtpërdrejt nga lëngjet trupore të pacientit ( reaksioni zingjiror i polimerazës, PCR). Me këtë metodë mund të krijohen dhe veçohen sasi të mëdha të gjeneve specifike apo të pjesëve të tyre. Një qasje e tillë ka gjetur përdorim të madh në diagnozën e shpejtë të tuberkulozit.

Ndihmesë diagnostike në laboratorin e mikrobiologjisë mund të ofrojë edhe vrojtimi i drejtpërdrejtë mikroskopik i disa mostrave klinike të pacientit për praninë eventuale të baktereve – p.sh. vrojtimi mikroskopik i M.tuberculosis në këlbazë (baciloskopia).

Në diagnozën e infeksioneve mikrobike përdoren edhe testet serologjike. Identifikimi i përgjigjes me antitrupa ndaj agjensit infektiv në serumin e pacientit mund të jetë i suksesshëm disa javë pas shfaqjes së infeksionit.